IF=6.2！首医大牛丕业教授团队破译锰神经毒性奥秘：铁死亡通路成关键“突破口”

英文标题：Multi-omics analysis reveals Mn exposure affects ferroptosis pathway in zebrafish brain

中文标题：多组学分析揭示锰暴露对斑马鱼大脑铁死亡途径的影响

发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

影响因子：6.1

客户单位：首都医科大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro
 

研究背景

锰(Mn)是人体必需的微量元素，同时也是一种广泛存在的职业性毒物和环境污染物。中枢神经系统中过量的Mn积累会导致神经功能障碍，毒理学研究已证实，Mn可引发多种不良效应，包括发育毒性、心血管毒性、肝毒性、肾毒性及免疫毒性等。其中，Mn的神经毒性尤为受关注，因其可穿过血脑屏障并在脑内蓄积。既往研究表明，Mn诱导神经毒性的部分机制涉及氧化应激、代谢异常、神经炎症及细胞凋亡等，但由于大脑细胞存在组成复杂性和异质性，在单细胞水平上对Mn诱导神经毒性的分子机制研究仍较为有限。本研究采用单细胞测序技术(scRNA-seq)筛选出斑马鱼大脑中在Mn暴露下受影响显著且在神经毒性过程中起关键作用的神经元类型，并结合基因表达谱和非靶标代谢组学研究Mn对斑马鱼神经毒性的机制。
 

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研究结果

1、锰暴露后斑马鱼脑单细胞图谱的构建

为了更好地了解Mn暴露对斑马鱼脑中不同细胞类型的影响，研究者绘制了斑马鱼大脑在不同Mn暴露水平（对照组、低暴露组、高暴露组）下的单细胞图谱。通过分析共鉴定了21个细胞簇（图1A），并通过标记基因鉴定了10种细胞类型：胆碱能神经元、DA神经元（多巴胺能神经元）、谷氨酸能神经元、GABA能神经元、神经元前体、其他神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、放射状胶质细胞和未定义细胞。图1C可视化了每个细胞簇中标记基因的表达情况，图1D显示了各组中细胞类型的占比情况。与对照组相比，低暴露组中胆碱能神经元的比例增加0.347%，但在高暴露组中减少了3.405%；DA神经元在低暴露组中增加了0.251%，但在高暴露组中减少了1.186%；GAB能神经元在低暴露组和高暴露组中分别显著增加了4.449%和3.373%。这些结果表明，Mn暴露可以改变胆碱能神经元、DA神经元和GABA能神经元的细胞类型比例。

图1. 斑马鱼脑的单细胞图谱

2、锰暴露对斑马鱼脑神经元类型分化轨迹的影响

神经元是大脑接收、整合、传导和传递信息的基本结构和功能单位。因此，研究者对不同亚型的神经元进行了进一步分析，获得了12个并列的细胞簇（图2A）。值得注意的是，胆碱能神经元、DA神经元、谷氨酸能神经元和GABA能神经元这四种主要神经元类型，在这些亚簇中呈现独立的分布模式。通过拟时序分析将不同表达水平的基因按轨迹进行排序，结果显示，随着Mn暴露剂量的增加，神经元逐渐趋向轨迹的末端，这在一定程度上验证了所构建轨迹的合理性。

进一步将拟时序分析结果与细胞类型结果比对发现，对照组中以DA神经元和胆碱能神经元为主导，而Mn暴露后，神经元类型的主导模式呈现明显动态变化，依次转变为以GABA能神经元、谷氨酸能神经元和未定义的中间态神经元为主导。

基于拟时序分析，将表达水平发生显著变化的基因划分为三个功能模块（图2C）。下调基因主要富集于核糖核蛋白复合体生物合成、蛋白质折叠、细胞代谢过程、G蛋白偶联受体信号通路及对温度刺激的响应等过程，其中281个下调基因与细胞代谢功能密切相关（簇1）；上调基因模块（簇2）显著富集于ATP代谢过程、大分子生物合成调控、G蛋白偶联受体活性、昼夜节律调控及电子传递链相关通路；簇3的模块代表基因表达变化的中间状态，可能反映神经元类型转换的动态过程。综上结果表明，Mn暴露不仅促使神经元类型主导模式从DA神经元向GABA能神经元转变，还动态调控了与细胞代谢相关的基因表达程序，进而影响神经元的功能状态。

图2. 聚类和拟时序分析识别斑马鱼脑神经元细胞的转录动态变化

3、多组学联合分析锰对斑马鱼脑神经元铁死亡信号通路的破坏作用

为了探讨锰神经毒性的转录调控机制和代谢组学途径，研究首先对Mn暴露后神经元中的差异表达基因(DEGs)进行了鉴定分析。在低暴露组中，谷氨酸能神经元中有289个DEGs，DA神经元中有170个，GABA能神经元中有49个，胆碱能神经元中有27个（图3A）。在高暴露组中，所有类型的细胞中观察到更多的DEGs，其中多巴胺神经元中有413个DEGs，谷氨酸能神经元中有141个，GABA能神经元中有107个，胆碱能神经元中有66个（图3B）。

采用非靶标代谢组学鉴定代谢物变化（图3C-D），在低暴露组中检测到66个差异代谢物(DEMs)，在高暴露组中检测到63个DEMs（图3E-F）。

图3. 锰暴露后斑马鱼脑的转录组学变化与代谢重编程

由于Mn暴露显著影响神经元的转录组和代谢组，研究者进一步对神经元中DEGs和DEMs富集的代谢通路进行了联合分析（图4A-B）。代谢途径表明，Mn对细胞代谢途径的影响随Mn剂量的增加而显著改变。在低暴露和高暴露组中，甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢在多种细胞类型中富集。Mn影响参与脂质代谢、氨基酸代谢和葡萄糖代谢途径的代谢物水平，特别是在DA神经元中。通过KEGG信号通路分析进一步探索Mn暴露后神经元代谢通路涉及的信号通路。结果显示，在高暴露组中，胆碱能神经元有62条富集通路， GABA能神经元有43条富集通路。在高暴露组中富集的134条DA神经元通路中，发现铁死亡通路包含12个DEGs和3个DEMs（图4C）。在低暴露组中，铁死亡通路中也有7个DEGs和3个DEMs富集。谷氨酸和GSSG的水平随着Mn暴露剂量的增加而增加，而GSH则呈剂量依赖性下降趋势。在DA神经元中，基因hmox1b的表达在Mn暴露后显著升高。与此同时，gpx4a、slc40a1和sat1a.2的表达与Mn浓度成反比下降。此外，acsl2、gclc、slc3a2b、ncoa4和map1lc3cl的表达仅在高暴露组中显著下降。同时，在其他神经元中，没有观察到Mn暴露后铁死亡相关基因表达的显著差异。

图4. 多组学联合分析锰对斑马鱼脑神经元铁死亡信号通路的影响

研究结论

该研究构建了成年斑马鱼慢性Mn暴露模型，绘制了斑马鱼脑单细胞图谱，并在单细胞水平上研究了Mn暴露后斑马鱼神经元的转录组学特征。非靶标代谢组学的结果揭示了Mn暴露下斑马鱼脑的代谢重编程。本文通过多组学的联合分析，发现Mn暴露破坏了斑马鱼DA神经元中的铁死亡信号传导通路，从而揭示了铁死亡途径是Mn致神经毒性的新型潜在机制。

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END

刘华岐 撰文

Tang 校稿